3. การคัดเลือกหายีนในเมตาจีโนมจากตัวอย่างดีเอ็นเอในดินที่เกี่ยวข้องในการย่อยสลายโพลีแซคคาไรด์

วัตถุประสงค์
            เพื่อศึกษา จำแนกและ ได้มาซึ่งข้อมูลของยีนที่เกี่ยวข้องในการย่อยสลายสารประเภทโพลีแซคคาไรด์จากเมตาจีโนมิค
ไลบรารีย์ที่สร้างจากดีเอ็นเอที่แยกได้จากแหล่งดิน  
ที่มาของโครงการและข้อมูลเบื้องต้น
            จุลินทรีย์ที่แยกได้จากดินนับเป็นแหล่งของสารชีวภาพสำคัญหลายชนิดที่ใช้ทางการแพทย์และเกษตรกรรม อาทิเช่น สารปฏิชีวนะ, สารต้านจุลชีพ, สารต้านมะเร็ง, ยาฆ่าแมลง, ยาปราบวัชพืช, สารกดภูมิคุ้มกัน เป็นต้นก็ตามเป็นที่น่าสังเกตว่า ในปัจจุบันอัตราการค้นพบสารชีวภาพชนิดสำคัญใหม่ๆนั้นมีแนวโน้มที่ลดลงเป็นอย่างมาก สาเหตุเนื่องมาจากการคัดเลือกได้จุลินทรีย์ชนิดเดิมๆ ซ้ำแล้วซ้ำเล่าเมื่อใช้วิธีการคัดเลือกและเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์แบบมาตรฐานที่ใช้โดยทั่วไป นอกจากนี้การวิเคราะห์ข้อมูลเกี่ยวกับ DNA community ของจุลินทรีย์ในสิ่งแวดล้อม และ งานวิจัยทางนิเวศวิทยาของจุลินทรีย์ ทำให้เป็นที่ทราบกันดีว่าประชากรจุลินทรีย์ที่สามารถเพาะเลี้ยงในห้องปฏิบัติการโดยวิธีการมาตรฐานนั้นนับเป็นส่วนน้อยคิดเป็น 1 % เมื่อเทียบกับประชากรจุลินทรีย์ทั้งหมดที่มีอยู่ในธรรมชาติ ดังนั้นจึงมีความเป็นไปได้อย่างมากว่าสารชีวภาพที่สำคัญ รวมไปถึง กลุ่มยีนที่ควบคุมการการสังเคราะห์อีกมากมายยังมิได้ถูกค้นพบและยังมิได้มีการนำไปใช้ให้เกิดประโยชน์สูงสุด อันเนื่องมาจากข้อจำกัดด้านการเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์นี้ ปัจจุบันจึงมีการพัฒนาเทคนิคทางชีวโมเลกุลที่ทำให้สามารถขจัดปัญหาข้อจำกัดในการเพาะเลี้ยง โดยทำการสกัดแยกดีเอ็นเอโดยตรงจากตัวอย่างที่นำมาจากสิ่งแวดล้อม อาทิ เช่น ดิน น้ำ ตะกอนของเสีย เป็นต้น โดยให้คำนิยามของดีเอ็นเอผลรวมที่สกัดได้เหล่านี้ว่า เมตาจีโนม (metagenome) และ เทคนิควิธีการที่ใช้ในการวิเคราะห์ยีนของประชากรจุลินทรีย์ ณ สิ่งแวดล้อมหนึ่งๆ เรียกว่า เมตาจีโนมิค (metagenomic) โดยทั่วไปการวิเคราะห์เมตาจีโนมจะประกอบด้วยการแยกดีเอ็นเอจากตัวอย่างที่ได้จากธรรมชาติ ดีเอ็นเอที่ได้จะถูกชักนำเข้าสู่เวคเตอร์ (vector) ที่เหมาะสมเพื่อสร้างเป็นเมตาจีโนมิคไลบรารี่ย์ (metagenomic library) และให้มีการแสดงออกของยีนต่างๆ จาก ไลบรารี่ย์ ใน surrogate host ที่เลือกสรรแล้ว
             การสร้างเมตาจีโนมิคไรบรารี่ย(Construction of metagenomic library): ในการสร้างเมตาจีโนมิคไลบรารี่ย์จะเริ่มต้นด้วยการนำตัวอย่างจากแหล่งธรรมชาติที่เราสนใจมาสกัดดีเอ็นเอโดยวิธีทิ่เหมาะสม นำมาผ่านขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ขึ้นเนื่องจากตัวอย่างดีเอ็นเอจากธรรมชาติมักมีการปนเปื้อนด้วยสารอินทรีย์ในดิน จากนั้นดีเอ็นเอที่มีความบริสุทธิ์เพียงพอจะใช้เพื่อโคลนเข้าสู่เวคเตอร์ เมตาจีโนมิคไลบรารี่ย์สามารถแบ่งออกเป็น 2 ประเภทตามแต่เวคเตอร์ที่ใช้ ได้แก่ 1) การสร้างเมตาจีโนมิคไลบรารี่ย์ที่บรรจุชิ้นดีเอ็นเอขนาดเล็ก (Small insert library) ไลบรารี่ย์ประเภทนี้จะบรรจุชิ้นดีเอ็นขนาดไม่เกิน 10 kb โดยประมาณ ในพลาสมิด (plasmid) และมักใช้ E. coli เพื่อเป็นโฮสท์ในการแสดงออกของยีนที่มีขนาดเล็ก แต่อาจไม่เหมาะสมเมื่อต้องการศึกษาการแสดงออกของกลุ่มยีนขนาดใหญ่ 2) การสร้างเมตาจีโนมิคไลบรารี่ย์ที่บรรจุชิ้นดีเอ็นเอขนาดใหญ่ (Large insert library) ไลบรารี่ย์ประเภทนี้จะบรรจุชิ้นดีเอ็นเอขนาดใหญ่ได้ต่างกันขึ้นกับเวคเตอร์ที่ใช้ อาทิเช่น คอสมิด (cosmid) ซึ่งสามารถบรรจุชิ้นดีเอ็นขนาด 25-35 kb ได้, Bacterial artificial chromosome (BAC) สามารถบรรจุชิ้นดีเอ็นเอขนาดใหญ่ถึง 200 kb ได้ เป็นต้น ในขณะที่ E.coli ยังถูกเลือกใช้เป็นโฮสท์สำหรับการแสดงออกของไลบรารี่ย์ในกลุ่มนี้เช่นกัน นอกจากนี้ยังมีการเลือกใช้ Streptomyces lividans เป็นโฮสท์สำหรับการแสดงออกกลุ่มยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างสารปฏิชีวนะด้วย
               การวิเคราะห์เมตาจีโนมิคไลบรารี่ย์ (Analysis of metagenomic library): มี 2 วิธีการในการวิเคราะห์เมตาจีโนมิคไลบรารี่ย์เพื่อคัดเลือกหาโคลนที่สร้างสารชีวภาพและชี้บ่งยีนที่เกี่ยวข้อง ได้แก่ 1) functional-based screening และ 2) sequencing-based screening โดยในวิธีการแรกจะเป็นการตรวจสอบคุณสมบัติทางกายภาพและชีวเคมีของโคลนที่อยู่ในไลบรารี่ย์ ตัวอย่างเช่น ความสามารถในการสร้างเอนไซม์ชนิดต่างๆ ที่ย่อยสลายสารตั้งต้นแต่ละประเภท และความสามารถในการสร้างสารต้านแบคทีเรียและสารปฏิชีวนะชนิดใหม่ๆ ส่วนวิธีการคัดเลือกวิธีการที่สองจะอาศัยลำดับเบสที่เป็นส่วนอนุรักษ์ (conserved DNA sequence) นำมาใช้สร้างเป็น hybridization probe หรือ PCR primer เพื่อตรวจหาโคลนที่มีลำดับเบสที่สนใจ
           ดังนั้นโครงการวิจัยนี้จึงมุ่งเน้นเพื่อจำแนกหายีนที่เกี่ยวข้องในการสังเคราะห์เอนไซม์ประเภทต่างๆที่มีคุณสมบัติในการ
ย่อยสลาย เปลี่ยนแปลงโครงสร้างของสารในกลุ่มโพลีแซคคาไรด์ อาทิเช่น Amylases, Cellulases, b-glucanase, และ Xylanases รวมถึงเอนไซม์อื่นๆที่เกี่ยวข้องในกลุ่ม จะเห็นได้ว่าเอนไซม์เหล่านี้ล้วนเป็นเอนไซม์ที่มีคุณค่าทางอุตสาหกรรมและการวิจัยทางเทคโนโลยีชีวภาพเป็นอย่างมาก นอกจากนี้ผลที่ได้รับจากโครงการวิจัยนี้จะเป็นแนวทางในการศึกษาและจำแนกกลุ่มยีนอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องในการสร้างสารประกอบทางชีวภาพสำคัญชนิดอื่นๆ โดยอาศัยเทคนิคการสร้าง Metagenomic library โดยตรงจากสิ่งแวดล้อม

รูปที่ 1: แผนผังการวิเคราะห์โดยใช้เทคนิคเมตาจีโนมิคเพื่อคัดเลือกหายีนที่สร้างสารชีวภาพ 
(ปรับปรุงจาก Sharma et al., 2005)

รูที่ 2: คุณลักษณะของดีเอ็นเอที่สกัดได้จากตัวอย่างดิน